酸热法破碎解脂假丝酵母细胞壁提取神经酰胺条件的优化赵静陈国强2，周全2，林会兰2（1青海大学农牧学院，青海西宁810003 2清华大学生物科学与技术系，北京100084）：S852.通讯作者：陈国强3教授博知研究究生bookmark2目前，已研究出的破碎酵母细胞壁的方法很多，如酸热处理法、自溶法、高压匀浆法、超声波破碎法等，特别是用酸热处理法破碎酵母细胞壁，可提高蛋白质和氨基酸的总量。为了解酸热处理法是否能提高解脂假丝酵母细胞中神经酰胺的含量，进行了如下试验，现将结果报道如下。

　　1材料与方法11材料清华大学生物科学与技术系微生物实验室提供。

　　试剂：色谱纯正己烷、乙醇，购自迪马公司（北京）HCl为分析纯。

　　12方法121细胞培养将保存在4 *C的解脂假丝酵母接种在YPD斜面培养基中，30*C培养24h再将斜面菌种接种到100mLYPD液体培养基中，摇床培养24h（30C转速200rmin）得液体菌种。取10mL液体菌种加入100mLYPD液体培养基中，上摇床培养24h得细胞培养液。6 20min加少量纯化水悬浮细胞，洗2次，得到酵母湿细胞。

　　122酸热处理条件酸浓度处理：分别将1g解脂假丝酵母湿细胞浸泡于浓度为123mol/L的3以盐酸中，60以1后于沸水浴中放置3迅速冷却，加入4倍体积的甲醇，50C水浴30min加入8倍体积的氯仿，50C水浴30min加入3倍体积水，使氯仿、甲醇、水的体积比为8：4：3充分振荡，静置，待分层后用分液漏斗提取下层有机相，真空干燥后定容于氯仿，经固相萃取法纯化后进行TLC及HPLC分析。

　　热处理时间：用2molL的盐酸3mL浸泡解脂假丝酵母湿细胞1g60mn后于沸水浴中分别放置1510mn迅速冷却，同上提取神经酰胺。

　　21：赵静（1967-），女，副教授，硕士。

　　浸泡时间：用2molL的盐酸3mL浸泡解脂假丝酵母湿细胞1g时间分别为204060min然后于沸水浴中放置5min迅速冷却，同上提取神经酰胺。

　　123薄层色谱分析（TLC）将纯化后的样品溶于不同容积的氯仿中，取20ML样品上样。展开剂为氯仿、甲醇、冰乙酸（体积比为19：0 9：01），展开后的硅胶板用硫酸铜溶液显色，晾干后160*C烘20min124高效液相色谱分析（HPLC-ELSD）液相色40C空气压力3 5X105Pa检测灵敏度为8色谱柱为AlltimaCN柱（5卩L46X250mm，Alltech美国）。洗脱剂为正己烷乙醇（99/1），流速为0mLmin定量分析时以标样浓度C和样品峰面积A为参数作出双对数曲线，对神经酰胺进行定量。

　　2结果1薄层色谱分析（TLC）采用不同盐酸浓度、热处理时间、浸泡时间破碎解脂假丝酵母细胞壁提取神经酰胺，作薄层色谱分析。结果表明，在2mol/L的盐酸中浸泡60min然后于沸水浴中放置5min迅速冷却，神经酰胺的含量高，为佳破碎条件，见。

　　动物保健品采用不同盐酸浓度、热处理时间、浸泡时间破碎解脂假丝酵母细胞壁提取神经酰胺，进行HPLC-ELSD定量分析，结果见从可以看出，其结果与一致。

　　3讨论据报道，真核细胞中普遍含有的神经酰胺，可以保持水分，促进水分吸收，从而起到延缓皮肤衰老，抗皱纹的功效。从酵母中提取神经酰胺是一种方便和经济的方法。

　　试验通过不同酸热处理条件对解脂假丝酵母细胞中神经酰胺提取含量的研究，筛选出了2molL的盐酸，浸泡60min热处理5min迅速冷却为佳破壁条件。此法操作简便，省时，不受设备条件的限制，且成本低廉，破碎效果较好。

　　酸热处理法破碎细胞壁，主要是利用盐酸对细胞壁中的某些成分的作用，改变这些物质的空间结构，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，再经沸水浴的速冷处理，胞壁结构得以破坏，胞内物质溢出。从、可以看出，盐酸浓度、热处理时间、浸泡时间3种影响解脂假丝酵母细胞壁神经酰胺含量的因素中，盐酸浓度的影响尤为明显，其次是浸泡时间，后是热处理时间。

　　酵母脂类初提液中不仅含有神经酰胺，还含有大量的干扰物质，如三酰甘油、麦角固醇等。利用硅胶柱层析（SPE法），通过改变洗脱剂的极性，即先用氯仿丙酮（8洗涤，能除去酵母脂类初提液中的大部分三酰甘油和麦角固醇杂质，接着用氯仿甲醇（9：1）洗涤，将杂质和神经酰胺初步分离，得到较纯的酵母神经酰胺样品，结果较清晰，同时可排除其在液相色谱中对神经酰胺分析的影响，并能起到保护色谱柱的作用。试验使用滤纸以防止硅胶渗漏，效果较好，便于操作。据报道，采用2层玻璃棉较好，同时，如果能够利用恒流泵加样品和洗脱液，可能会收到更好的效果。

　　在进行薄层色谱分析时，由于杂质易于扩散，若点样点过于接近，杂质会连成一条线，干扰结果的判断。因此，在操作中应注意TLC的点样距离尽量保持在15on.此外，在扩散完后，应将硅胶板在空气中多放置一段时间，再干烤，这样斑点清晰，而且各样品间的干扰较小。

　　国产硫酸安普霉素对鸡在体盲肠内常在菌的影响及其对鸡的保护作用罗永江胡振英郑继方尚若峰张新国张正海2，孟伟民2，牛志强2（1中国农科院兰州畜牧与兽药研究所农业部新兽药工程重点实验室，甘肃兰州73005Q 2山东鲁抗舍里乐药业有限公司，山东济宁272000）硫酸安普霉素是美国礼莱公司从黑暗链霉菌发酵产物中分离出来的一种氨基糖甙类抗生素，它能抑制细菌蛋白质的合成，结构特殊，与目前临床应用的氨基糖甙类抗生素不易产生交叉耐药性，抗菌谱广，基金项目：甘肃省自然科学基金资助项目（GS012-A41-m6-ffi）对革兰阴性菌和阳性菌均有很强的抑制或杀灭作用，在国外已经用于防治大肠杆菌、沙门杆菌等引起的腹泻、肠炎，巴氏杆菌引起的败血症、小牛腹泻及火鸡肠道疾病等，但对鸡在体肠道菌的影响及其保护作用方面还未见报道，遂以国产硫酸安普霉素作为试验药物，进行以下试验，现报道如下。

　　1材料与方法